Tizenhárom éves korától lépett fel nyilvánosan. A pesarói konzervatóriumban, majd a római operaiskolában tanult, a milánói Scala színpadán 1943-ban Puccini Bohéméletében debütált. Pályája elején egyik legnagyobb sikerét Veronában Verdi Aidájában, Radamesként aratta, a következő években meghódította a londoni Covent Garden és a New York-i Metropolitan közönségét is, a Metben a Manon Lescaut-t egymás után száz alkalommal énekelte.
A jóképű, kiváló színpadi adottsággal és átérző képességgel rendelkező hőstenor repertoárján 36 opera szerepelt, elsősorban Bizet, Verdi és Puccini művei. Karizmatikus személyiségével, erős és érces hangjával, kifejező előadásmódjával magával ragadta közönségét. 1959-ben ő volt az első igazán neves külföldi énekes a moszkvai Nagy Színházban, ahol művésztársai vállukon vitték le a színpadról. Del Monaco az előadás után a be nem jutott rajongóknak öltözője ablakából rögtönzött a capella koncertet olasz dalokból. Budapesten is többször vendégszerepelt.
Legemlékezetesebb - és számára is legkedvesebb - alakítása Verdi Otellójának címszerepe volt. A velencei mór jelmezét legelőször 1950-ben Buenos Airesben, utoljára 1972-ben Brüsszelben öltötte magára, a szerepet több mint két évtized alatt 427 (hivatalos források szerint "csak" 218) alkalommal énekelte - mindkét szám rekordot jelent. Pályafutása csúcsán, a múlt század derekán a legnagyobb szopránokkal (Maria Callas, Renata Tebaldi) énekelt.
A színpadtól 60 évesen, 1975-ben búcsúzott el, de lemezfelvételeket a későbbiekben is készített, emellett tanítással is foglalkozott. Élete végéig szívesen lépett fel templomokban, ahol orgonakísérettel énekelt vallásos tárgyú zeneműveket. Lemezei a Decca cégnél jelentek meg, ezek közül jó néhány CD-változatban is kapható. Leghíresebb felvételein természetesen szerepel az Otelló is, amelynek mindkét változatában Renata Tebaldi énekli Desdemonát, s a második felvétel karmestere Herbert von Karajan.
Mario del Monaco 1982. október 16-án halt meg a Velence melletti Mestrében autóbaleset következtében. Kívánságának megfelelően legkedvesebb szerepe, Otelló jelmezében temették el.
