Huszonegy éves korában visszatért szülővárosába, megnősült, megnyitotta saját posztóboltját és közösségi szolgálatba lépett.
Negyvenéves koráig nem számított tudósnak, bár előszeretettel foglalkozott üveglencsék metszésével és csiszolásával - ez a tevékenység hamarosan a szenvedélyévé vált. A mikroszkópkészítés alapjait - a pár milliméter átmérőjű, kifogástalan gömbölyűségű lencsék köszörülésétől kezdve a foglalatok öntéséig és kovácsolásáig - fokról fokra sajátította el különböző mesteremberektől. Hamarosan 160-szoros nagyítást ért el egyszerű lencséivel - ettől kezdve életét a mikroszkopikus tanulmányoknak szentelte. Optikai eszközeit állandóan tökéletesítette, végül 300-szoros nagyítású, tökéletes képet adót tudott előállítani. Találmányait rendkívül féltékenyen őrizte, nem adta el egyetlen darabját sem, csak annyit engedett meg, hogy a kevésbé sikerülteket lakásán használhassák.
Metszeteket készített minden keze ügyébe kerülő tárgyról, élőlényről. Felboncolta a házi légy fejét, hogy agyvelejének alkotó elemeit tanulmányozza. Egy ebihal farkát vizsgálva megfigyelte, hogyan megy át a vér a hajszálerekben az artériákból a vénákba, és megállapította, hogy a vérben gördülő "golyócskák", vértestek vannak.
Tapasztalatait leírta, a látottakat lerajzolta, de csak akkor, ha már százszor is leellenőrizte azokat. Sok kiváló rajzot készített például az esővízben lakó parányi élőlényekről, a mikrobákról és a bacilusokról is, amelyek közül az elsőt 1674-ben pillantotta meg.
Nagyítóval végzett megfigyeléseiről a Királyi Tudós Társasághoz írt leveleiben számolt be, az elsőt 1673-ban keltezve. Levelei, amelyek 1695 és 1719 között A természetnek mikroszkópokkal felfedezett titkai címmel, összesen 4 kötetben jelentek meg, nagy érdeklődést keltettek. Tulajdonképpen ez a munka volt a mikrobiológia előfutára. Elvitathatatlan érdeme volt számos elem (a vörösvértestek, a spermiumok, a növények szárszerkezete, a harántcsíkolt izom, az agy szerkezete, a szemlencse) leírása. Nevéhez fűződik az a felfedezés is, hogy a bacilusok hővel elpusztíthatóak, bár az eljárást Pasteur tette világszerte ismertté. Leeuwenhoek volt az állati egysejtűekkel foglakozó tudomány, a protisztológia, sőt a kísérleti örökléstan megalapítója is.
Newton, valamint a híres vegyész, Robert Boyle mellett ő lett az angol tudós társaság, a Royal Society leghíresebb tagja, s neve lassan egész Európában ismert lett. Meglátogatta őt az orosz cár, Nagy Péter, sőt az angol királynő is, hogy megtekintse a mikroszkóp alatti csodálatos világot.
Felfedezésekben gazdag élete 91 éves korában, 1723. augusztus 27-én, Delftben ért véget. Halála után még százötven évnyi fejlődés kellett ahhoz, hogy az összetett mikroszkópok minőségben meghaladják az általa házilag készített nagyítókat.
Hagyatékában több mint 400 nagyítóüveget és készüléket találtak, ebből tíz példány napjainkban is fellelhető.
