Nagy szegénységben éltek, ezért már tízévesen munkába állt. Az alapismeretekre apja oktatta, később esti iskolába járt, és autodidakta módon latint tanult. Saját erőből 1836-tól a glasgow-i Anderson's Egyetemen görögöt, teológiát és orvostant hallgatott. 1938-ban felfüggesztette tanulmányait, és egy évet a Londoni Misszionárius Társaságnál töltött Essexben. 1840-ben Londonban szerzett orvosi oklevelet. Robert Moffat hittérítő hatására orvos-missziós szolgálatot vállalt. Hittérítővé szentelték; hajója 1841-ben ért Fokvárosba, ahonnan Becsuánaföldre ment.
Kurumaniból Fokföld határára utazott, és 1842-ben messzebb jutott a Kalahári-medencében, mint előtte bármely fehér ember. 1845-ben elvette Moffat lányát, aki később gyerekeikkel Angliába költözött.
Livingstone nevét az a William Cotton Oswell vezette expedíció tette ismerté, amelynek során 1849-ben eljutottak a Zambézi és a Cuando folyókig, és felfedezték a Ngami-tavat a mai Botswana területén. Eredményét a Brit Királyi Földrajzi Társaság aranyéremmel és pénzjutalommal honorálta, és támogatta későbbi útjai során is. Feljegyzései és térképei a legjobb földrajztudósok sorába emelték. Ugyan a Zambézi vidékén jártak már előtte felfedezők (többek között Magyar László is), ezeket a területeket mégis az ő leírásai alapján ismerte meg a világ.
1853-ban, a kontinens belseje felé indult. Célja a kereszténység és a civilizáció terjesztése, valamint a bennszülöttek legális kereskedelemre való ösztönzése volt, továbbá utat keresett az Atlanti-óceánhoz. Eljutott az angolai Luandába (1854), majd a Zambézi folyó mentén felfedezte a nagy "Mosi-oa-tunya" azaz a "Mennydörgő füst" vízesést, amelyet Viktória királynőről nevezett el. 1856-ban elért a mozambiki Quelimane-ba. Angliában kiadták Missziós utazások és kutatások című beszámolóját, nagy sikert aratott.
1858-ban jutott el a Nyasza-tóig, és fedezte fel a Chilwa-tavat. Élményeiről a "Beszámoló a Zambézi és mellékfolyói vidékére vezette expedícióról" könyvében számolt be. 1867-ben felfedezte a Mweru-, majd a Bangweulu tavat, és 1869-ben elért a Tanganyika-tóhoz, majd 1871-ben a Kongó egyik ágához. Ujijibe visszatérve találkozott a keresésére indult Sir Henry Morton Stanley-vel. Ekkor hangzott el a híres mondat: "Ugyebár Dr. Livingstone-hoz van szerencsém?" Bár a mai kutatások e kijelentést cáfolják, mégis visszavonhatatlanul legenda lett. Együtt jutottak el a Tanganyika-tó északi partjáig, és onnan Unyanyambébe, Angliába azonban nem jutott vissza. Elküldött jegyzetei Davis Livingstone utolsó naplója címmel jelentek meg.
A mai Zambia területén fekvő Chitambóban halt meg, testét a londoni Westminsterben temették el. Emlékét Afrikában a róla elnevezett hegység és a Kongó egyik vízesése őrzi.
